На иконе изображены сыновья крестителя Руси великого князя Владимира Святославича — святые мученики Борис и Глеб, вероломно убитые в 1015 году братом Святополком. Иконография святых сформировалась вскоре после их канонизации, не ранее 1037 года (?).

На иконе представлен один из вариантов иконографии: фронтальное изображение святых в рост. Он сложился под влиянием агиографических и богослужебных текстов, подчеркивающих мученический аспект культа святых и их княжеское достоинство, связываемое в первую очередь с воинским подвигом.

В текстах святые князья — защитники земли Русской от неверных. Этим объясняется изображение святых в княжеских одеяниях — хитонах с расшитыми каймами и поясами, шапках с меховыми опушками и плащах-корзно, подбитых горностаевым мехом, и с мечами в руках. Художественные особенности памятника позволяют применить его к работе выдающегося мастера XIV столетия — опытного рисовальщика и превосходного колориста. Икона принадлежит к тем редким произведениям древнерусской живописи, в которых внутреннее содержание образа и средства художественного выражения составляют единое нерасторжимое целое. Русский музей. От иконы до современности. СПб, 2015. С. 43.

На иконе представлен один из вариантов иконографии святых князей, вероятно восходящий к их надгробной иконе, установленной над мощами мучеников после их перенесения в Васильевский храм Вышгорода. Князья изображены в рост, во фронтальных позах, с крестами и мечами в руках. Их стройные юношеские фигуры облачены в роскошные княжеские одеяния — хитоны с расшитыми каймами и поясами, шапки с меховой опушкой и плащи-корзна, подбитые горностаевым мехом. Старший, более мужественный Борис изображен с небольшой бородкой, младший, Глеб, — безбородым, с рассыпанными по плечам прядями волос. Различие в возрасте и характере подчеркнуто и позами изображенных. Меч старшего — его прочное основание. Не случайно он уперт в землю, а не приподнят в нерешительности, как у младшего брата. Однако воинское достоинство, столь значимое для князей в повседневной жизни, является в художественном замысле иконы вторичным. Оказавшись в левой руке, меч теряет силу оружия, уступая эту функцию кресту. Главенство мученического аспекта над воинским усугубляется и характером одежд святых князей — отсутствием в них любого намека на доспехи ратника.

Подобная иконография святых князей Бориса и Глеба была распространена не только на Руси, но и в Византии. Одну из икон братьев-мучеников видел в Константинополе в 1200 году Добрыня Ядрейкович — будущий новгородский архиепископ Антоний. Появлению таких образов в странах византийского мира способствовали международные контакты Древней Руси, династические браки между членами великокняжеского дома и высокородными представительницами чужих земель. (Так, согласно летописным сведениям, мать святых Бориса и Глеба была «болгарыней»). Из числа сохранившихся русских икон раннего времени наибольшую близость к иконе из собрания Н. П. Лихачева обнаруживают образы XIII– XIV веков из Саввино-Вишерского монастыря (ныне — в Музее искусств имени Богдана и Варвары Ханенко, Киев) и новгородского Зверина монастыря (около 1399, ГИМ).
Монументальные размеры, глубокий символизм замысла и исключительные художественные достоинства иконы позволяют предполагать, что она являлась храмовым образом древней Борисоглебской церкви, возведенной на территории одного из среднерусских княжеств. Надежда Пивоварова // Электронный каталог «Святые земли русской». СПб. 2010. С. 21.

Борис и Глеб (при крещении получившие имена Роман и Давид) — первые и наиболее почитаемые русские святые, младшие сыновья святого равноапостольного Владимира, великого князя киевского (правил с 980 по 1015), крестившего Русь в 988. По преданию, они были убиты в 1015 своим братом Святополком Окаянным, устранявшим претендентов на киевский великокняжеский престол. Канонизированы в Константинополе после 1037 по ходатайству их брата Ярослава Мудрого.
Иконографический тип сложился в XI–XII веках. Образы страстотерпцев Бориса и Глеба соединяют черты мучеников и князей-воинов, заступников за Русскую землю. Ростовский князь Борис изображен с усами и бородой, юный Глеб, княживший в Муроме, – с распущенными по плечам волосами. В руках святых изображены крест – символ мученической смерти, и меч – атрибут княжеской власти.

Среди сохранившихся изображений Бориса и Глеба икона, принадлежащая Русскому музею, является одной из древнейших. Мнения о месте и времени ее создания разноречивы.